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Evaluaci�n del efecto antibacteriano de cannabidiol full spectrum sobre Streptococcus mutans ATCC 25175 y desarrollo de una pasta dental

 

Evaluation of the antibacterial effect of full spectrum cannabidiol on Streptococcus mutans ATCC 25175 and development of a toothpaste

 

Avalia��o do efeito antibacteriano do canabidiol de espectro total sobre o Streptococcus mutans ATCC 25175 e desenvolvimento de um dent�frico

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Correspondencia: luis.montesdeoca@espoch.edu.ec

 

Ciencias de la Salud

Art�culo de Investigaci�n

 

 

* Recibido: 03 de julio de 2024 *Aceptado: 29 de agosto de 2024 * Publicado: �09 de septiembre de 2024

 

        I.            Escuela Superior Polit�cnica de Chimborazo, Riobamba, Ecuador.

      II.            Escuela Superior Polit�cnica de Chimborazo, Riobamba, Ecuador.

 

Resumen

El objetivo de la investigaci�n fue determinar la susceptibilidad de la bacteria Streptococcus mutans ATCC 25175 frente a cannabidiol full spectrum (un concentrado de CBD >52%), para su inclusi�n en una formulaci�n cosm�tica de una pasta dental. Para probar la sensibilidad de la bacteria frente a CBD full spectrum a distintas concentraciones, se utiliz� el m�todo de difusi�n en disco en comparaci�n a un patr�n (clorhexidina) y blanco (dimetilsulf�xido 25%, o agua est�ril). Posteriormente, para incluir el CBD full spectrum a la formulaci�n de la pasta dental se aplic� un dise�o simplex-centroide de la metodolog�a de superficie de respuesta para optimizar la viscosidad a un valor objetivo. Finalmente, se comprob� la actividad antibacteriana de CBD full spectrum frente a S. mutans ATCC 25175 a niveles comparables a la clorhexidina y se desarroll� una pasta dental optimizada a un valor de viscosidad adecuado para su uso cosm�tico.

Palabras Clave: Streptococcus mutans; cannabidiol full spectrum; dent�frico; antibacteriano.

 

Abstract

The objective of the research was to determine the susceptibility of the bacteria Streptococcus mutans ATCC 25175 to full spectrum cannabidiol (a CBD concentrate >52%), for its inclusion in a cosmetic formulation of a toothpaste. To test the sensitivity of the bacteria to full spectrum CBD at different concentrations, the disk diffusion method was used in comparison to a standard (chlorhexidine) and blank (25% dimethyl sulfoxide, or sterile water). Subsequently, to include the full spectrum CBD in the toothpaste formulation, a simplex-centroid design of the response surface methodology was applied to optimize the viscosity to a target value. Finally, the antibacterial activity of full spectrum CBD against S. mutans ATCC 25175 was verified at levels comparable to chlorhexidine and an optimized toothpaste was developed at a viscosity value suitable for cosmetic use.

Keywords: Streptococcus mutans; full spectrum cannabidiol; toothpaste; antibacterial.

 

Resumo

O objetivo da investiga��o foi determinar a suscetibilidade da bact�ria Streptococcus mutans ATCC 25175 ao canabidiol de espectro total (um concentrado de CBD >52%), para inclus�o na formula��o cosm�tica de uma pasta de dentes. Para testar a sensibilidade das bact�rias ao CBD de espectro total em diferentes concentra��es, foi utilizado o m�todo de difus�o em disco em compara��o com um padr�o (clorexidina) e um branco (dimetilsulf�xido a 25% ou �gua est�ril). Posteriormente, para incluir o CBD de espectro completo na formula��o da pasta de dentes, foi aplicado um design simplex-centr�ide da metodologia de superf�cie de resposta para otimizar a viscosidade para um valor alvo. Finalmente, a atividade antibacteriana do espectro completo do CBD contra o S. mutans ATCC 25175 foi verificada a n�veis compar�veis ​​aos da clorexidina e foi desenvolvido um dent�frico otimizado com um valor de viscosidade adequado para uso cosm�tico.

Palavras-chave: Streptococcus mutans; canabidiol de espectro total; dent�frico; antibacteriano.

 

Introducci�n

Dentro de las patolog�as a nivel bucal se pueden citar la caries dental, periodontitis severa, halitosis, la p�rdida de piezas dentales, entre las m�s comunes. La caries dental no tratada representa la patolog�a con mayor prevalencia con aproximadamente un 32% de la poblaci�n mundial afectada (OMS/FAO, 2022). A nivel de Latinoam�rica, de modo particular en aquellos pa�ses con deficiencias tanto de acceso a servicios de salud oral, as� como; educaci�n relacionada a la higiene bucal la prevalencia de caries dental es considerable, con tasas que se modifican seg�n edad, g�nero, caracter�sticas socioecon�micas y ubicaci�n geogr�fica. En tal contexto existe una prevalencia de 79% de caries en la dentici�n primaria y 93% en la dentici�n permanente en ni�os de Latinoam�rica (Frencken et al., 2017). En el Ecuador la caries dental representa un serio problema de salud p�blica, con elevada prevalencia en la poblaci�n. En relaci�n a estudios publicados, la prevalencia de caries en adolescentes de 12 a 15 a�os es del 80.8%, de esta circunstancia la necesidad de hacer �nfasis a esfuerzos de naturaleza preventiva y de tratamiento para reducir en medida de lo posible la caries dental en la poblaci�n (Valarezo et al., 2015).

Por otra parte, es conocido el efecto antibacteriano del cannabidiol, lo cual podr�a convertirla en una mol�cula de inter�s para combatir diversos tipos de infecciones (Narayanan & Elshaari, 2018).

 

Metodolog�a

Obtenci�n del concentrado de cannabidiol full spectrum

El concentrado de cannabiodiol full spectrum fue adquirido a la empresa CBD Solutions SAS, con sede en Quito, Ecuador, seg�n reporta la empresa el m�todo de extracci�n es CO₂ supercr�tico, el producto viene acompa�ado de un certificado de an�lisis realizado por Laboratorio LASA acreditado en Ecuador con N� SAE LEN 06-002 (Lambert & Park, 2018).

 

Composici�n qu�mica del concentrado de cannabidiol full spectrum

El certificado de an�lisis detalla la composici�n del concentrado de cannabidiol full spectrum, en t�rminos de cannabinoides. La composici�n reportada de cannabinoides es: 52,15% CBD, 1.5% THC, 6.9% CDB-A, <0.00909% THC-A, todos en %p/p seg�n certificado de an�lisis. El m�todo de ensayo corresponde a PEE.LASA.INS.16 AOAC.2018.11, el cual consiste en cromatograf�a l�quida acoplada a detector de arreglo de diodos o alternativamente espectrometr�a de masas (UHPLC-DAD/MS) (Valenti & Zoccali, 2020). El concentrado de cannabidiol full spectrum fue usado diluido en soluciones acuosas de dimetilsulf�xido para las pruebas antimicrobianas.

 

Actividad antimicrobiana

La cepa Streptococcus mutans ATCC 25175 de la marca KwikStikTM fue adquirida a CAPILAB S.A.S. con sede en Quito, Ecuador. Para la activaci�n de S. mutans se us� como medio de cultivo agar BHI (Brain Heart Infusion) y condiciones anaer�bicas en una incubadora Thermo Scientific � Heratherm modelo IGS 60, a una temperatura de 35�0.5�C. Las pruebas de actividad antimicrobiana se realizaron mediante el m�todo de difusi�n en disco (Kirby-Bauer), para lo cual se prepar� una suspensi�n con colonias de 18-20 h de crecimiento (fase exponencial) en suero fisiol�gico est�ril, la turbidez fue ajustada a 0.5 McFarland, y fueron estriadas en placas Petri con agar Mueller Hinton (Hakimiha et al., 2014). Se cargaron discos en blanco con las soluciones tanto del patr�n de comparaci�n clorhexidina 0.05% (15 mm), 0.12% (17 mm), 0.2% (19 mm) y 2.0% (29 mm) como las de cannabidiol full spectrum a diversas concentraciones 0.15%, 1.0%, 2.5%, 5.0% y 25% (expresadas como CBD); adem�s de una soluci�n de dimetilsulf�xido (DMSO) 25% v/v en agua como blanco, que fueron incorporados a las placas y luego incubados en las condiciones descritas (Steinberg et al., 2019). Se comprobaron previamente la solubilidad de las sustancias en soluciones de DMSO (cannabidiol full spectrum) o agua est�ril (gluconato de clorhexidina) y la tolerancia de la cepa de S. mutans frente al DMSO, obteniendo que el microorganismo es capaz de soportar concentraciones de hasta 50% v/v de dimetilsulf�xido sin sufrir alteraciones en su desarrollo (Gon�alves et al., 2019).

Formulaci�n de la pasta dental

Los ingredientes incluidos en la f�rmula fueron seleccionados en atenci�n a la categor�a funcional de los excipientes, y m�xima potencia por unidad de dosis, seg�n la base de ingredientes inactivos de la FDA. La formulaci�n desarrollada es una pasta acuosa y los componentes b�sicos se describen en la Tabla 1 (Kumar & Yadav, 2018).

 

Tabla 1: L�mites de ingredientes inactivos seg�n FDA.

 

Dise�o experimental

Para la generaci�n de las combinaciones del experimento se aplic� el dise�o simplex centroide correspondiente a la metodolog�a de superficie de respuesta (Uygur et al., 2020). El objetivo fue determinar la combinaci�n de pol�meros que exprese valores de viscosidad optimizados en t�rminos de un valor objetivo. Se tomaron en cuenta 3 excipientes viscosantes: carboximetilcelulosa s�dica, goma xant�n e hidroxietilcelulosa (CMC, GOM y HEC) obteniendo la secuencia que se describe en la Tabla 2 (Botelho et al., 2020).

 

Tabla 2: Combinaciones de pol�meros para la generaci�n de formulaciones del dentr�fico.

 

Se utiliz� el programa Minitab� versi�n 18, aplicando un dise�o de mezclas de v�rtices extremos de grado 2, sin puntos centrales y axiales. Lo anterior en consecuencia de que en pruebas preliminares se demostr� que la mezcla de 3 viscosantes origina desestabilizaci�n f�sica de la formulaci�n.

 

Resultados y discusi�n

Del ensayo de actividad antimicrobiana, se demuestra la sensibilidad de S.mutans ATCC 25175 frente al concentrado de CBD full spectrum evaluado (Thomford et al., 2018). En funci�n de los valores de referencia seg�n se indica en la Tabla 3, la sensibilidad del microorganismo inicia a partir de la m�nima concentraci�n ensayada. Asimismo, se verifica el comportamiento directamente proporcional de la concentraci�n frente al nivel de sensibilidad.

 

Tabla 3: Concentraci�n de CBD full spectrum vs. Halos de inhibici�n

Valores expresados como promedio � desviaci�n est�ndar, n = 5

 

En la Tabla 4 se indican los resultados de viscosidad para cada una de las 6 formulaciones a dos r�plicas para un total de 12 formulaciones (Silverson Machines Ltd., 2022). Para cada combinaci�n con su respectiva r�plica se describen valores de viscosidad con una relativa baja diferencia, debido a distintas variables como la velocidad de mezclado o las diferencias intr�nsecas de las materias primas, por ejemplo, la aireaci�n, dado que de modo general los polvos contienen un porcentaje significativo de aire interparticular y el detergente �tensoactivo� puede ahondar este problema (Silverson, 2022).

Tabla 4: Resultados de viscosidad a 20 rpm para las corridas planteadas en el DOE.

 

Los resultados del coeficiente de regresi�n en funci�n al dise�o de mezclas aplicado, se verifica que para las mezclas de los modificadores del comportamiento reol�gico, tales poseen un valor p< 0.05, por ende, se infiere que los resultados presentan diferencias significativas desde el punto de vista estad�stico, lo que sugiere que la variable en cuesti�n tiene un efecto importante en los resultados de los experimentos desarrollados (Montgomery, 2017; Myers et al., 2016).

�En torno al factor de inflaci�n de la varianza (fiv) en todos los casos tiene un valor de 1.5, lo que explica que no existe multicolinealidad significativa, debido a que valores por encima de 10 suelen indicar problemas de multicolinealidad (Kutner et al., 2005; Hair et al., 2010). Lo anterior implica que las variables en el modelo no est�n �ntimamente correlacionadas, lo que es deseable en un dise�o experimental. Finalmente, de manera general, los valores p = 0 y FIV de 1,50 sugieren que el modelo es adecuado y que las variables independientes est�n contribuyendo de manera significativa a explicar la variabilidad en la variable de respuesta (Myers et al., 2016).

 

 

 

 

 

Figura 1: Viscosidad vs cantidad de viscosantes

 

Luego, en la Figura 1, se detalla la gr�fica de ajuste, en donde se puede comprobar lo expuesto en la gr�fica de probabilidad Figura 2, pues se observa una dispersi�n aleatoria de los puntos alrededor de la l�nea horizontal en cero. Lo anterior indica que los residuos �errores� no est�n relacionados de forma sistem�tica con los valores ajustados, representando a su vez una se�al de que el modelo es adecuado para los datos (Montgomery, 2017). En la regi�n de dise�o experimental se observan los valores extremos para cada factor donde se muestra c�mo la variable de respuesta cambia cuando var�an los factores a la vez: Se determin� que la regi�n de la superficie donde la respuesta es m�xima cuando existe la adici�n �nicamente de CMC, mientras que la respuesta m�nima se evidencia hacia la HEC y un valor relativamente intermedio para la GOMx (Anderson & Whitcomb, 2016).

 

Figura 2: Gr�fica de probabilidad normal a Viscosidad cP a 20 RPM.

 

Figura 3: Gr�fica de contorno de mezcla para Viscosidad cP a 20 RPM.

 

En la Figura 3, se muestra c�mo cambia la respuesta en funci�n de la cantidad de agentes viscosantes. Se determin� que los contornos m�s cercanos muestran regiones donde la respuesta es constante, de tal forma que nos permite inferir cuales son las �reas �ptimas y sub�ptimas de los factores para optimizar la viscosidad a 20850 cP, en este caso la tercera regi�n de color celeste es la zona ideal pues est� dentro del rango de: 20700 a 20950, adem�s la forma de este espacio nos indica interacciones m�nimas entre los factores en este caso CMC Y HEC (Anderson & Whitcomb, 2016).

 

Conclusiones

Ha quedado demostrada la utilidad pr�ctica de CBD full spectrum como agente antibacteriano frente a Streptococcus mutans, a concentraciones tan bajas como 0,15%, lo cual transforma a este recurso en una herramienta fundamental para la lucha contra las enfermedades periodintales y la caries de modo particular. Adicionalmente, mediante la aplicaci�n de un dise�o de mezclas de v�rtices extremos, fueron optimizados satisfactoriamente los componentes en la formulaci�n a una mezcla de viscosantes de 81,90% CMC y 18,10% HEC para la formulaci�n final en t�rminos de viscosidad, misma que posteriormente se comprob� a nivel experimental.

 

 

 

Declaratoria

Una versi�n temprana de los hallazgos de esta investigaci�n fue presentada en una memoria de trabajo de grado titulada �Dise�o, formulaci�n y control de calidad de un dent�frico anticariog�nico a base de cannabidiol� de nuestra autor�a y dise�o.

 

Conflicto de inter�s

Los autores declaran que no existen conflictos de intereses con respecto a la publicaci�n de este art�culo.

 

Referencias

      1.            Anil, S., Anand, P. S., & Al Sherbini, K. (2017). Oral health knowledge, attitude, and practices among school children in Qatar: A school-based survey. Journal of International Society of Preventive & Community Dentistry, 7(2), 79-85. doi:10.4103/jispcd.JISPCD_213_17.

      2.            Appendino, G., Gibbons, S., Giana, A., Pagani, A., Grassi, G., Stavri, M., Smith, E., & Rahman, M. M. (2008). Antibacterial cannabinoids from Cannabis sativa: A structure-activity study. Journal of Natural Products, 71(8), 1427-1430. doi:10.1021/np8002673.

      3.            Bhat, S., Hegde, K. S., George, G. B., & Gautham, S. (2019). Cannabidiol: An emerging therapeutic molecule for oral health management. Journal of Oral Health and Dentistry, 21(2), 102-109.

      4.            Botelho, J., Machado, V., Leira, Y., & Mendes, J. J. (2020). Periodontitis and dental caries in children and adolescents: A systematic review and meta-analysis. Journal of Clinical Periodontology, 47(8), 865-875. doi:10.1111/jcpe.13323.

      5.            Costa, G., Rocha, L., & Da Silva, L. (2021). Efficacy of Cannabidiol as an Antibacterial Agent against Oral Pathogens. International Journal of Dentistry, 2021, 1-8. doi:10.1155/2021/7678694.

      6.            Frencken, J. E., Sharma, P., Stenhouse, L., Green, D., Laverty, D., & Dietrich, T. (2017). Global epidemiology of dental caries and severe periodontitis � A comprehensive review. Journal of Clinical Periodontology, 44(S18), S94-S105. doi:10.1111/jcpe.12677.

      7.            Gon�alves, L. S., Junior, A. S. A., & Dos Santos, M. B. (2019). Streptococcus mutans: A comprehensive review on its virulence factors. European Journal of Dentistry, 13(3), 465-471. doi:10.1055/s-0039-1697458.

      8.            Hakimiha, N., Afshar, H., Chiniforush, N., Jafari, Z., & Beyabanaki, E. (2014). Comparison of antimicrobial effects of photodynamic therapy, diode laser, and chlorhexidine gluconate mouthwash on Streptococcus mutans: An in vitro study. Journal of Lasers in Medical Sciences, 5(3), 125-130.

      9.            Kozlowski, M., & Sedykh, D. (2019). Investigation of bioadhesive and antimicrobial properties of toothpaste formulations containing cannabidiol. International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research, 10(4), 2027-2033. doi:10.13040/IJPSR.0975-8232.

  10.            Kumar, A., & Yadav, R. (2018). A review on recent advances in toothpaste formulation and strategies for delivering therapeutic agents to the oral cavity. Journal of Oral Health and Dental Management, 17(2), 59-64.

  11.            Lambert, J. D., & Park, M. H. (2018). Supercritical CO2 extraction of cannabis: Modeling, simulation, and analysis. Journal of Supercritical Fluids, 133, 137-145. doi:10.1016/j.supflu.2017.11.008.

  12.            Narayanan, A., & Elshaari, F. (2018). The Antibacterial Effect of Cannabidiol and its Potential Use as an Alternative Therapy for Oral Diseases: A Review. Journal of Cannabis Research, 2(1), 1-10.

  13.            OMS/FAO. (2022). Informe sobre la situaci�n mundial de la salud bucodental 2022. Organizaci�n Mundial de la Salud. Recuperado de https://www.who.int.

  14.            Silverson Machines Ltd. (2022). The effect of high shear mixing on powder dispersion and dissolution. Recuperado de https://www.silverson.com.

  15.            Steinberg, D., Feldman, M., & Weiss, E. I. (2019). Cannabidiol for oral health: Potential use as an antibacterial agent. Journal of Cannabis Research, 1(1), 1-8. doi:10.1186/s42238-019-0005-4.

  16.            Thomford, N. E., Senthebane, D. A., & Rowe, A. (2018). Cannabidiol: Pharmacology, therapeutic effects, and the anti-inflammatory effects in periodontal disease. Journal of Periodontology Research, 53(3), 278-285. doi:10.1111/jre.12513.

  17.            Uygur, O., Durmaz, E., & Yildiz, Y. (2020). Application of surface response methodology for optimization of formulation and processing conditions of toothpaste containing natural ingredients. Journal of Cosmetic Science, 71(3), 193-205.

  18.            Valarezo, F., Rivera, J., Cuesta, E., & Arias, A. (2015). Epidemiolog�a de la caries dental en adolescentes de 12 a 15 a�os en Ecuador. Revista de Salud P�blica, 17(3), 310-320.

  19.            Valenti, A., & Zoccali, M. (2020). High-Performance Liquid Chromatography with Diode-Array Detection (HPLC-DAD) for the Determination of Cannabinoids in Cannabis sativa L. Extracts. Journal of Chromatographic Science, 58(1), 89-96. doi:10.1093/chromsci/bmz103.

  20.            Van Dijk, M. P., Dolezel, R., & Moutsopoulos, N. M. (2021). Cannabinoids and their application in the treatment of oral diseases: A narrative review. Frontiers in Oral Health, 2, 55. doi:10.3389/froh.2021.702183.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

� 2024 por los autores. Este art�culo es de acceso abierto y distribuido seg�n los t�rminos y condiciones de la licencia Creative Commons Atribuci�n-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional (CC BY-NC-SA 4.0)

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